Реагенты для очистки и выделения нуклеиновых кислот синтол. Состав набора для выделения днк «днк-сорб-пцр» Набор реагентов для выделения геномной ДНК "ДНК-Экстран"
Экспресс-метод выделения ДНК на микроколонках разработан для выделения тотальной ДНК из крови, плазмы, слюны, мочи, культур клеток и любых осадков клеток в буфере. Высокая чистота выделенной ДНК позволяет использовать её для всех видов анализа.
- эффективное связывание ДНК с мембраной колонки позволяет получить наибольший выход ДНК из образца;
- высокая степень очистки достигается благодаря оптимизированному составу компонентов лизирующего и промывочных растворов;
- значительно снижена фрагментация и потери ДНК при отмывках по сравнению с другими сорбентными методами выделения;
- возможно провести концентрирование ДНК за счет уменьшения объема элюирующего раствора;
- выделение ДНК на колонках существенно уменьшает расход дополнительного пластика;
- максимальный объем пробы - 200 мкл;
- набор содержит Протеиназу К;
- чистота выделенной ДНК составляет 1,8-1,9 по соотношению A260/A280;
- количество выделенной ДНК зависит от типа и количества образца. Выход ДНК из 200 мкл крови составляет в среднем 5-6 мкг.
время выделения составляет от 30 до 45 минут в зависимости от числа образцов;
Набор реагентов для выделения геномной ДНК "ДНК-Экстран"
С помощью наборов для выделения геномной ДНК серии «ДНК-Экстран» можно выделять ДНК из разнообразного биологического материала: крови, культур бактериальных и животных клеток, свежих, замороженных или высушенных тканей животных и растений.
- полное экстрагирование ДНК из клеток, минимизация потерь и фрагментации ДНК при очистке;
- выделенная ДНК имеет высокий уровень чистоты (соотношение А260/А280 = 1,8-1,9) и пригодна для ПЦР, рестрикции, гибридизации и других исследований;
- наборы не содержат таких потенциально опасных компонентов, как фенол и хлороформ, не требуют большого расхода пластика и не образуют токсичного мусора.
Набор реагентов для выделения ДНК на магнитных частицах "М-Сорб-Туб"
Адаптирован для выделения ДНК микобактерий из мокроты, промывных вод бронхов, спинномозговой жидкости, экссудата, пунктата, биоптата, мочи, отделяемого половых путей, культур клеток. Предварительная обработка клинического материала проводится в соответствии со стандартными процедурами пробоподготовки при микробиологических исследованиях (Приказ № 109 Минздрава РФ 21 марта 2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», приложение 11 «Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза»). Для инактивации клинического материала рекомендуем использовать разработанный нами инактивирующий раствор А.
Раствор А убивает микобактерии в течение 12 часов и обеззараживает клинический материал, который можно использовать для дальнейшего анализа (выделения ДНК, ПЦР и т.д.). Раствор А адаптирован специально для обработки мокроты и полностью заменяет стандартную процедуру с использованием раствора NaOH-NALC, обладает исключительными муколизирующими свойствами. Инактивирующий раствор А увеличивает выход ДНК по сравнению со стандартной пробоподготовкой NaOH-NALC .
Методика выделения включает: лизис ДНК изотиоцианатом гуанидина, сорбцию ДНК на магнитных частицах, осаждение ДНК центрифугированием, стадии промывок и элюцию ДНК. Может быть использован для выделения ДНК других микроорганизмов.
использование в качестве сорбента покрытых силикагелем магнитных частиц является более технологичным и удобным форматом по сравнению с другими сорбентами, позволяет максимально стандартизировать и автоматизировать методику выделения ДНК;
в каждый исследуемый образец добавляется внутренний положительный контроль (ВПК), по реакции амплификации ВПК судят о наличии/отсутствии ингибиторов ПЦР-РВ и эффективности выделения ДНК.
Наборы реагентов для выделения ДНК из пищевых продуктов и продовольственного сырья
Наборы реагентов «Сорб-ГМО-А» и «Сорб-ГМО-Б» разработаны специально для выделения ДНК из растительного сырья, пищевых продуктов и кормов. В обоих наборах для очистки ДНК используется кремниевый сорбент. «Сорб-ГМО-А» в качестве лизирующего агента содержит гуанидин хлорид, «Сорб-ГМО-Б» — ионный детергент СТАВ, которые обеспечивают максимальный выход ДНК из растительных компонентов. Отличительными особенностями набора «Сорб-ГМО-А» являются быстрота выделения ДНК и отсутствие хлороформа, что делает работу с набором более безопасной.
Набор реагентов для выделения ДНК из проб воды (на магнитных частицах) "М-Сорб-Лег"
Разработан для выделения ДНК легионелл из водных объектов окружающей среды (градирни, бассейны, аквапарки, системы горячего и холодного водоснабжения). Минимальная выделяемая концентрация легионелл — 100 клеток в 0,5 л образца.
Набор «М-Сорб-Лег» производится в двух модификациях: «М-Сорб-Лег1000» для проб воды объёмом 1-1000 мл и «М-Сорб-Лег1» для проб воды объёмом до 1 мл. В наборе «М-Сорб-Лег1000» предусмотрена фильтрация воды с помощью поликарбонатного фильтра.
- методика выделения ДНК основана на сорбции ДНК на покрытых силикагелем магнитных частицах с последующим осаждением преципитирующим реагентом. Сочетает в себе достоинства сорбционных методов и метода тотального осаждения;
- в каждый исследуемый образец добавляется внутренний положительный контроль (ВПК), по реакции амплификации ВПК судят о наличии/отсутствии ингибиторов ПЦР-РВ.
набор реагентов «М-Сорб-Лег» позволяет избавиться от ингибиторов ПЦР, присутствующих в сильнозагрязнённых образцах воды;
Набор реагентов для выделения ДНК из объектов окружающей среды (на магнитных частицах) "М-Сорб-ООМ"
Набор реагентов «М-Сорб-ООМ» предназначен для выделения ДНК из объектов окружающей среды (почва, вода, трупы животных и др.), подозрительных на заражённость особо опасными микроорганизмами (ООМ), с целью их подготовки для последующего анализа методом ПЦР-РВ. Методика выделения аналогична описанной для набора «М-Сорб-Лег».
Набор реагентов для выделения РНК "РНК-Экстран"
Набор предназначен для выделения РНК из крови, фрагментов тканей, культур клеток. Полученную с помощью набора «РНК-Экстран» РНК можно использовать как для ОТ-ПЦР, так и для гибридизационного анализа, трансляции in vitro, клонирования.
Принцип выделения РНК основан на кислой фенольной экстракции по Хомчинскому, при которой в водной фазе остаётся только РНК, а ДНК в комплексе с белками переходит в органическую фазу. В качестве изирующего и денатурирующего клеточные нуклеазы агента используется гуанидинтиоцианат.
- время выделения РНК - 1 час.
позволяет получить высокоочищенную РНК, свободную от примесей ДНК;
обеспечивает полное экстрагирование РНК из цельной крови, тканевых фрагментов и клеточных культур;
позволяет получить неповреждённую РНК;
| каталожный номер | название | количество реакций |
| EX-509 | Набор реагентов “ДНК-Экстран -1” для выделения геномной ДНК из цельной крови | 100 |
| EX-511 | Набор реагентов “ДНК-Экстран-2” для выделения ДНК из тканей животных и человека | 100 |
| EX-512 | Набор реагентов “ДНК-Экстран-3” для выделения ДНК из культур бактерий | 100 |
| EX-513 | Набор реагентов “ДНК-Экстран-4” для выделения ДНК из тканей растений | 100 |
| EX-514 | Набор реагентов “К-Сорб” для выделения тотальной ДНК на колонках (из крови, слюны, мочи, культур клеток, соскобов эпителиальных клеток) | 100 |
| EX-515 | Набор реагентов "РНК-Экстран" для выделения РНК из крови, тканей, культур клеток | 50 |
| OM-505 | Набор реагентов “М-Сорб-Туб” для выделения ДНК из клинических образцов и культур клеток (на магнитных частицах) | 50 или 100 |
| GM-502-50 | “СОРБ-ГМО-А” (гуанидин+сорбент) Набор реагентов для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов | 50 |
| GM-503-50 | “СОРБ-ГМО-Б” (ЦТАБ+сорбент) Набор реагентов для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов | 50 |
| OM-506 | Набор реагентов “М-Сорб-Лег1000” для выделения ДНК легионелл из проб воды объёмом до 1000 мл (на магнитных частицах, фильтры поставляются отдельно) | 50 или 100 |
| OM-507 | Набор реагентов “М-Сорб-Лег1” для выделения ДНК легионелл из проб воды объёмом до 1 мл (на магнитных частицах) | 50 или 100 |
| OOM-502 | Набор реагентов “М-сорб-ООМ” для выделения ДНК из объектов окружающей среды (на магнитных частицах) | 50 или 100 |
Информация для заказа
| Наименование | Объем | Производство | Метод | Кат.Номер |
|---|---|---|---|---|
| “ГМО-МагноСорб” (гуанидин + магнитный сорбент) Набор реагентов для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов | 50 выделений | Синтол | ПЦР в реальном времени | GM-505-50 |
| “СОРБ-ГМО-А” (гуанидин+сорбент) Набор реагентов для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов | 50 | Синтол | ПЦР в реальном времени | GM-502-50-50 |
| “СОРБ-ГМО-Б” (ЦТАБ+сорбент) Набор реагентов для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов | 50 | Синтол | ПЦР в реальном времени | GM-503-50-50 |
| Набор реагентов “Амплитуб-РВ” комплект №1 (“М-Сорб-Туб“) для выде ления ДНК микобактерий из клинических образцов и куль турклеток (на магнитных частицах) | 50 | Синтол | ПЦР в реальном времени | OM-505 |
| Набор реагентов “ДНК-Экстран -1” для выделения геномной ДНК из цельной крови | 100 | Синтол | ПЦР в реальном времени | EX-509-100 |
| Набор реагентов “ДНК-Экстран-2” для выделения ДНК из тканей животных и человека | 100 | Синтол | ПЦР в реальном времени | EX-511 |
| Набор реагентов “ДНК-Экстран-3” для выделения ДНК из культур бактерий | 100 | Синтол | ПЦР в реальном времени | EX-512-100 |
| Набор реагентов “ДНК-Экстран-3” для выделения ДНК из тканей растений | 100 | Синтол | ПЦР в реальном времени | EX-513-100 |
| Набор реагентов “К-Сорб” для выделения тотальной ДНК на колонках (из крови, слюны, мочи, культур клеток, соскобов эпителиальных клеток) | 100 | Синтол | ПЦР в реальном времени | EX-514-100 |
| 48 реакций | Синтол | ПЦР в реальном времени | GM-443-48 | |
| Набор реагентов «Соя/ 35S+FMV / NOS скрининг» | 50 реакций | Синтол | ПЦР в реальном времени | GM-416-50 |
Лизирующий раствор 30 cм 3 ,
Отмывочный раствор 1 30 cм 3 ,
Концентрат для отмывочного раствора 2 20 cм 3 ,
Суспензия сорбента 2 cм 3 ,
Буфер для элюции ДНК 4 cм 3 .
Порядок работы:
Приготовить отмывочный раствор 2, для этого в отдельном флаконе смешать 20 cм 3 концентрата из набора, 80 cм 3 дистиллированной воды и 100 cм3 96% этанола. Хранить раствор при комнатной температуре в плотно завинчивающемся флаконе.
Проверить состояние сорбента – при отстаивании он должен занимать приблизительно половину объема суспензии.
В плотно закрывающуюся полипропиленовую пробирку на 1,5 cм 3 (желательно с завинчивающейся крышкой) внести по 100 мкл предварительно подготовленной исследуемой пробы, отрицательной или положительной пробы, добавить по 300 мкл лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным наконечником) и тщательно перемешать пипетированием 3-10 раз.
Добавить 15 – 20 мкл ресуспендированного сорбента, хорошо перемешать на вортексе, поставить в штатив на 5-7 мин для полного осаждения сорбента.
Осадить сорбент на микроцентрифуге в течение 30 сек при 3-8 тыс. об./мин. Отобрать супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать вакуумный отсос).
Добавить по 300 мкл отмывочного раствора 1, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента (если сорбент плохо разбивается разбить его при помощи пипетки), осадить на центрифуге при 4-8 тыс.об./мин в течение 30 сек. Отобрать супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником.
Добавить по 800 мкл отмывочного раствора 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, осадить на микроцентрифуге при 6-10 тыс.об./мин в течение 30 сек, отобрать супернатант.
Повторить п. 6, тщательно отобрать супернатант, высушить осадок сорбента в термостате при 65 °С, в течение 5 мин.
Ресуспендировать сорбент в 30-40 мкл элюирующего буфера, поместить в термостат на 65°С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
Осадить на микроцентрифуге при максимальных оборотах 1 мин.
Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.
В качестве отрицательного контроля на этапе выделения ДНК необходимо использовать физраствор или деионизованную воду.
Эффективность выделения ДНК с помощью набора «ДНК-сорб-ПЦР» составляет 30 – 60%.
|
Клинический материал |
Плазма, сыворотка |
Соскоб, сперма, фаренгиальные смывы, моча |
Биоптат, кровь, фекалии |
|
Число пипетирований | |||
|
Объем сорбента | |||
|
Скорость осаждения сорбента |
8 тыс.об/мин |
6 тыс.об./мин |
3-4 тыс об./мин |
|
Объем элюента | |||
|
Эффективность выделения ДНК |
5.2. Этап 2. Постановка пцр состав набора для проведения пцр-амплификации:
5-кратный реакционный буфер.1000 мкл (вязкий прозрачный раствор синего цвета)
Деионизованная вода.2000 мкл
Смесь нуклеотидов.500 мкл
Taq-полимераза.100 мкл
Смесь праймеров.500 мкл
Воск для ПЦР.2000 мкл
Положительный контроль.100 мкл
Отрицательный контроль 100 мкл
Минеральное масло 4000 мкл
Набор хранится при минус 20°С в течение года.
««ДНК-сорб-С-М» ® АмплиСенс ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Только для исследовательских Российская Федерация, 111123, и иных немедицинских целей город Москва, ...»
ИНСТРУКЦИЯ
по применению комплекта реагентов
для экстракции ДНК из биологического материала
«ДНК-сорб-С-М»
АмплиСенс
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора,
Только для исследовательских
Российская Федерация, 111123,
и иных немедицинских целей
город Москва, улица Новогиреевская, дом 3А
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
НАЗНАЧЕНИЕ
ПРИНЦИП МЕТОДА
ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ОТ ЖИВОТНЫХ................ 8
КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ ИЛИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯСИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ
Форма 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / стр. 2 из 15
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота НК – нуклеиновые кислоты ОК – отрицательный контроль экстракции ОКО – отрицательный контрольный образец ПК – положительный контроль экстракции ПКО – положительный контрольный образец ПЦР – полимеразная цепная реакция
– Федеральное бюджетное учреждение науки
ФБУН ЦНИИ
«Центральный научно-исследовательский институт Эпидемиологии эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере Роспотребнадзора защиты прав потребителей и благополучия человекаНАЗНАЧЕНИЕ
Комплект реагентов «ДНК-сорб-С-М» предназначен для экстракции ДНК из биологического материала от животных: тканевой (биопсийный (кожа и слизистые оболочки мочеполовой системы, ЖКТ, бронхов), операционный и аутопсийный) материал; и экстракции ДНК из продуктов питания, биологических добавок, кормов для животных или растительного сырья для последующего исследования методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).Экстракция ДНК является преаналитической процедурой метода ПЦР.
Объем исследуемого образца для экстракции: 100 мкл (допускается исследование образцов объемом от 10 до 100 мкл или весом от 10 до 100 мг)1.
ВНИМАНИЕ! Информацию о порядке взятия, условиях транспортирования и хранения исследуемого материала, необходимости и порядке его подготовки к экстракции ДНК, а также информацию об интерферирующих веществах и ограничениях, связанных с пробой, смотрите в инструкции к используемому набору реагентов для проведения амплификации.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Исследуемый образец2 обрабатывается лизирующим раствором с протеиназой К, в результате чего происходит деструкция клеточных мембран, высвобождение НК и клеточных компонентов. Растворенные НК связываются с частицами сорбента, в то время как другие компоненты лизированного исследуемого материала остаются в растворе и удаляются при осаждении сорбента В зависимости от исследуемого материала, см. инструкцию к используемому набору реагентов для амплификации.Для некоторых видов биологического материала требуется этап пробоподготовки. См.
инструкцию к используемому набору реагентов для проведения амплификации.
Форма 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / стр. 3 из 15 центрифугированием и последующей отмывкой сорбента. При добавлении буфера для элюции к сорбенту происходит переход НК с поверхности силики в раствор, который отделяется от частиц сорбента центрифугированием. В результате указанной процедуры получается высокоочищенный препарат НК, свободный от ингибиторов реакции амплификации, что обеспечивает высокую аналитическую чувствительность ПЦР-исследования.
ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ
Комплект реагентов выпускается в 2 формах комплектации:
Форма 1 включает комплект реагентов «ДНК-сорб-С-М» вариант 50.
Форма 2 включает комплект реагентов «ДНК-сорб-С-М» вариант 100.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ
При исследовании биологического материала от животных работа должна проводиться согласно правилам МСХиП РФ 27.01.1997 г. № 13-7-2/840 «Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения», утвержденным Департаментом ветеринарии.При исследовании продуктов питания, биологических добавок, кормов для животных или растительного сырья работа должна проводится с соблюдением требований методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности» и ГОСТ Р 53214-2008 «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов.
Общие требования и определения».
При работе необходимо всегда выполнять следующие требования:
– Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции, продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы, оборудование и реагенты в зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса.
– Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, а также Форма 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / стр. 4 из 15 использованные реагенты, упаковку3, биологический материал, включая материалы, инструменты и предметы, загрязненные биологическим материалом, следует удалять в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».
– Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических дозаторов с фильтром4. Одноразовую пластиковую посуду необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания медицинских отходов.
– Посуда (ступки и пестики) и металлические инструменты (скальпели, ножницы, пинцеты, насадки для блендера и т.п.), использованные для преподготовки проб, выдерживаются в растворе дезинфицирующего средства (например, 0,2 % раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты) в течение одного часа, моются водопроводной водой с поверхностно-активными моющими средствами и, после отмывания в проточной и деионизованной воде, высушиваются в сухожаровом шкафу в течение 4 часов при температуре 180 С.
– Комплект реагентов предназначен для одноразового применения для проведения исследования указанного количества проб (см. раздел «Состав»).
– Комплект реагентов готов к применению согласно данной инструкции.
Применять комплект реагентов строго по назначению.
– Не использовать комплект реагентов, если нарушена внутренняя упаковка или внешний вид реагента не соответствует описанию.
– Не использовать комплект реагентов, если не соблюдались условия транспортирования и хранения согласно инструкции.
Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, использованные реагенты, упаковка относятся к классу опасности медицинских отходов Г.
Для удаления надосадочной жидкости в процессе экстракции с помощью вакуумного отсасывателя используются одноразовые наконечники без фильтра.
Форма 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / стр. 5 из 15
– Не использовать комплект реагентов по истечении срока годности.
– Использовать одноразовые неопудренные перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во время работы с образцами и реагентами. Тщательно вымыть руки по окончании работы. Все операции проводятся только в перчатках для исключения контакта с организмом человека.
– Избегать вдыхания паров, контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой, не глотать. При контакте немедленно промыть пораженное место водой, при необходимости, обратиться за медицинской помощью.
– Листы безопасности реагентов (SDS –safety data sheet) доступны по запросу.
Оценка вероятных событий, в результате наступления которых могут произойти отрицательные последствия для организма человека:
При использовании по назначению и соблюдении вышеперечисленных мер предосторожности контакт с организмом человека исключен.
При аварийных ситуациях возможно следующее:
– раздражение слизистой оболочки глаз у чувствительных лиц,
– раздражение кожи у чувствительных лиц,
– аллергическая реакция,
– вред при вдыхании,
– вред при приеме внутрь.
Специфические воздействия комплекта реагентов на организм человека:
– Канцерогенный эффект отсутствует.
– Мутагенное действие отсутствует.
– Репродуктивная токсичность отсутствует.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
(с указанием фирм-производителей / поставщиков):1. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 и 5,0 мл (например, Axygen, Inc.
(«Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
2. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 200 и до 1000 мкл (например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
3. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
Форма 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / стр. 6 из 15
4. Штативы для пробирок объемом 1,5 мл (например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
5. Ламинарный бокс класс биологической безопасности II тип А (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», ЗАО «Ламинарные системы», Россия, или аналогичный).
6. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, SIA Biosan, Латвия, или аналогичный).
7. Термостат-шейкер для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, TS-100, SIA Biosan, Латвия, или аналогичный).
8. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» с максимальной скоростью центрифугирования не менее 12 тыс g (например, MiniSpin, Eppendorf («Эппендорф Мануфэктуринг Корпорэйшн»), Manufacturing Corporation Германия, или аналогичная).
9. Вортекс (например, SIA Biosan, Латвия, или аналогичный).
10.Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», ООО «Утес», Россия, или аналогичный).
11.Автоматические дозаторы переменного объема (например, ООО «Биохит», Россия, или аналогичные).
12.Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 С.
13.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
14.Одноразовые пластиковые контейнеры для сброса и инактивации материалов.
– – –
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ОТ ЖИВОТНЫХ
2. Отобрать необходимое количество одноразовых полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл с завинчивающимися или плотно закрывающимися крышками (включая отрицательный и положительный контроли экстракции, если они предусмотрены для проведения ПЦР-исследования).
При хранении буфера для лизирующего реагента и раствора для отмывки 1 при температуре от 2 до 8 С возможно образование осадка в виде кристаллов.
Форма 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / стр. 8 из 15
3. Внести в каждую пробирку по 10 мкл ВКО6 (если он предусмотрен для проведения ПЦР-исследования). Добавить в пробирки по 400 мкл буфера для лизирующего реагента и по 17 мкл лизирующего реагента.
4. Внести в приготовленные пробирки по 100 мкл исследуемых образцов6, используя для каждого образца отдельный наконечник с фильтром.
ВНИМАНИЕ! 400 мкл буфера для лизирующего реагента и 17 мкл лизирующего реагента можно внести в пробирку с необходимым количеством исследуемого образца и туда же внести 10 мкл ВКО7 (если он предусмотрен для проведения ПЦР-исследования), используя отдельные наконечники с фильтром.
5. В пробирку отрицательного контроля (ОК) экстракции внести 100 мкл ОКО, в пробирку положительного контроля (ПК) экстракции внести 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО (если контроли экстракции предусмотрены для проведения ПЦРисследования).6
6. Плотно закрыть крышки, тщательно перемешать и осадить капли на вортексе.
Поместить пробирки в термостат с температурой 64 °С на 1 ч, периодически перемешивая на вортексе (5 раз через каждые 10–12 мин). Допускается инкубация в течение 12 ч при температуре 60 °С.
7. Осадить нерастворенные частицы образцов центрифугированием в течение 5 мин при 10 тыс g (например, 12 тыс об/мин для микроцентрифуги MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).
8. Отобрать надосадочную жидкость в объеме 200–350 мкл очень аккуратно (избегая попадания взвешенных частиц и капель жира) отдельными наконечниками с фильтрами и перенести в новые пробирки. Осадить капли на вортексе.
9. Ресуспендировать сорбент универсальный, интенсивно перемешивая на вортексе. Добавить в каждую пробирку отдельным наконечником по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального, плотно закрыть крышки.
Перемешать на вортексе, оставить в штативе на 10 мин, перемешивая через каждые 2 мин.
Допускается изменение объема исследуемых и контрольных образцов, см. инструкцию к используемому набору реагентов для проведения амплификации.
Форма 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / стр. 9 из 15
18.Повторить процедуру отмывки, следуя пп. 15–16, удалить надосадочную жидкость полностью.
19.Поместить пробирки с открытыми крышками в термостат с температурой 64 °С на 5–10 мин для подсушивания сорбента универсального.
20.Добавить в пробирки по 50–100 мкл буфера для элюции B (см. инструкцию к используемому набору реагентов для проведения амплификации).
Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Поместить в термостат с температурой 64 °С на 5–10 мин, периодически (1 раз в мин) перемешивая на вортексе.
Очищенная ДНК может храниться при температуре от 2 до 8 °С в течение недели, при температуре от минус 24 до минус 16 °С в течение 6 мес и при температуре не выше минус 68 °С в течение года. Для этого необходимо, не захватывая сорбент, перенести надосадочную жидкость в новую пробирку.
Форма 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / стр. 10 из 15
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ, БИОЛОГИЧЕСКИХ ДОБАВОК,
КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ ИЛИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
ВНИМАНИЕ! Порядок подготовки биологического материала к экстракции ДНК и объем исследуемого образца смотрите в инструкции к используемому набору реагентов для проведения амплификации1. Прогреть буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки 1, если они хранились при температуре от 2 до 8 °С, при температуре 64 °С до полного растворения кристаллов.
2. Выставить в штатив пробирки объемом 1,5 мл с предварительно обработанными исследуемыми образцами (объем/количество образца см. в инструкции к используемому набору реагентов для проведения амплификации).
3. Подготовить одноразовую полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл с завинчивающейся или плотно закрывающейся крышкой для отрицательного контроля экстракции (ОК). В пробирку внести 100 мкл ОКО.
4. Добавить в пробирки с исследуемыми образцами и ОК по 400 мкл буфера для лизирующего реагента и по 17 мкл лизирующего реагента.
5. Плотно закрыть крышки, тщательно перемешать и осадить капли на вортексе.
Поместить пробирки в термостат с температурой 64 °С на 1 ч, периодически перемешивая на вортексе (5 раз через каждые 10–12 мин), либо использовать термостат-шейкер.
6. Осадить нерастворенные частицы образцов центрифугированием в течение 5 мин при 10 тыс g (например, 12 тыс об/мин для микроцентрифуги MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).
7. Отобрать необходимое количество новых одноразовых полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл с завинчивающимися или плотно закрывающимися крышками.
8. Ресуспендировать сорбент универсальный, интенсивно перемешивая на вортексе. Добавить в каждую пробирку отдельным наконечником по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального, плотно закрыть крышки.
9. Из пробирок с лизированными образцами отобрать надосадочную жидкость в объеме 200–350 мкл очень аккуратно (избегая попадания взвешенных частиц и капель жира) отдельными наконечниками с фильтрами и перенести в пробирки с сорбентом. Перемешать на вортексе, оставить в штативе на 10 мин, перемешивая через каждые 2 мин.
Форма 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / стр. 11 из 15
10.Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 1 мин при 2 тыс g (например, 5 тыс об/мин для микроцентрифуги MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).
11.Не захватывая сорбент, удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником без фильтра на 200 мкл, используя вакуумный отсасыватель.
12.Добавить в пробирки по 300 мкл раствора для отмывки 1, плотно закрыть крышки, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального.
13.Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 1 мин при 2 тыс g.
14.Не захватывая сорбент, удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником без фильтра на 200 мкл, используя вакуумный отсасыватель.
15.Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 2, плотно закрыть крышки, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального
16.Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 1 мин при 7 тыс g (например, 10 тыс об/мин для микроцентрифуги MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).
17.Не захватывая сорбент, удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником без фильтра на 200 мкл, используя вакуумный отсасыватель.
18.Повторить процедуру отмывки, следуя пп. 15-16, удалить надосадочную жидкость полностью.
19.Поместить пробирки с открытыми крышками в термостат с температурой 64 °С на 5-10 мин для подсушивания сорбента универсального.
20.Добавить в пробирки по 50 мкл буфера для элюции B. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Поместить в термостат с температурой 64 °С на 5–10 мин, периодически (1 раз в мин) перемешивая на вортексе.
21.Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 1 мин при 10 тыс g. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.
Очищенная ДНК может храниться при температуре от 2 до 8 °С в течение недели, при температуре от минус 24 до минус 16 °С в течение 6 мес и при температуре Форма 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / стр. 12 из 15 не выше минус 68 °С в течение года. Для этого необходимо, не захватывая сорбент, перенести надосадочную жидкость в новую пробирку.
СРОК ГОДНОСТИ, УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ.
Срок годности. 12 мес. Комплект реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано иное.Транспортирование. Комплект реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 С не более 5 сут в термоконтейнерах, содержащих хладоэлементы, всеми видами крытых транспортных средств. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.
Хранение. Комплект реагентов хранить при температуре от 2 до 25 С, кроме лизирующего реагента. Лизирующий реагент хранить в холодильной камере при температуре от 2 до 8 С.
Холодильные камеры должны обеспечивать регламентированный температурный режим.
